Proteomika – high-tech „rybárstvo“

Žijeme v dobe, ktorá jazyk pravidelne obohacuje množstvom nových slov, výrazov a pojmov. Oblasti poznania a informácie, ktoré ich napĺňajú, sa množia rýchlejšie, ako nám ľudské schopnosti umožňujú tento proces pochopiť. „Proteomika“ je nová oblasť vedy, ktorá sa objavila pomerne nedávno. Predmetom jej štúdie sú proteíny - „ťažné kone“ akejkoľvek bunky. Záujem o tieto zlúčeniny je spôsobený nielen ich obrovskou úlohou vo fungovaní živých organizmov, ale aj tým, že môžu slúžiť ako ciele pre tvorbu nových liekov.

Slovo "proteín", ktoré vo vedeckej literatúre zvyčajne znamená proteín(vysokomolekulárna organická zlúčenina, ktorá je reťazcom aminokyselín), je odvodená z gréčtiny proteíny- „originál“. Jeho etymológia presne popisuje úlohu bielkovín pri udržiavaní života bunky akéhokoľvek organizmu – od baktérií až po človeka.

Ale pojem „proteóm“ je pravdepodobne známy iba odborníkom. Je zaujímavé, že ho vynašiel v roku 1994 austrálsky študent M. Wilkins, ktorý sa vo svojej diplomovej práci snažil nájsť krátky názov pre kompletnú sadu ľudských proteínov namiesto trápnej frázy „všetky proteíny vyjadrené genómom“. Hneď nasledujúci rok sa vo vedeckej tlači objavil termín „proteomika“, ktorý označuje nový smer v molekulárnej biológii (Wasinger a kol., 1995).

Treba poznamenať, že samotný návrh na „vytvorenie atlasu molekulárnych proteínov ľudí“ bol vyslovený asi pred tridsiatimi rokmi (Anderson, 1985). Ale v tom čase to bolo skôr želanie, ktoré bolo technologicky nemožné splniť. Čo sa zmenilo za posledné desaťročia? Po prvé, bol úspešne implementovaný program genomiky, vrátane vývoja technológií rýchleho sekvenovania DNA a vytvorenia databáz nukleotidových sekvencií. Druhý predpoklad je spojený s explozívnym rozvojom inštrumentálnych metód: hmotnostná spektrometria proteínov a peptidov (malé reťazce aminokyselín), ako aj elektroforéza a chromatografia, používané na separáciu organických molekúl.

Tieto faktory umožnili vznik novej „high-tech“ biologickej disciplíny.

Hojnosť bielkovín

Na rozdiel od genómov, proteómy, teda kompletné súbory bunkových proteínov, sú reprezentované aktívnym súborom molekúl, ktoré sa neustále upravujú. Navyše, ak sa biochémia zaoberá jednotlivými izolovanými molekulami, tak v prípade proteómu máme do činenia s obrovským molekulárnym bazénom (vhodné je prirovnať k rybe ulovenej na udicu a množstvu rýb prinesených záťahovou sieťou). ).

Z týchto ustanovení vyplývajú ciele a zámery vedy o proteomike. V prvom rade je táto disciplína zodpovedná za proteínovú „taxonómiu“ – súpis všetkých proteínov kódovaných v genóme konkrétneho organizmu, čo zahŕňa aj konštrukciu molekulárnych proteínových atlasov jednotlivých buniek, orgánov a tkanív.

Zaujímavejšou a oveľa dôležitejšou úlohou (nazvime ju „fyziologickou“) je však stanovenie princípov interakcie medzi proteínmi, ako aj stanovenie zákonitostí regulácie ich práce počas tzv. post-translačná modifikácia(zmena) bielkovín. Je to dôležité pre hľadanie nových markerov patologických procesov (ochorení) v ľudskom organizme.

Faktom je, že k posttranslačnej modifikácii proteínov dochádza v bunke po ich syntéze ako odpoveď na nejakú vonkajšiu poruchu alebo chorobu. V dôsledku toho sa vlastnosti proteínov môžu rýchlo meniť, čo ovplyvňuje rýchlosť ich syntézy a degradácie. V konečnom dôsledku sa výsledok takýchto procesov prejaví na celkovom proteínovom profile. Jeho štúdiom možno objaviť bielkoviny, ktorých „produkcia“ v stave choroby sa líši od „zdravej normy“. Takéto proteíny sa môžu použiť na diagnostické účely ako biomarkery konkrétneho ochorenia.

Funkčné, konštrukčné a medicínske

Proteomika je mladá veda, no výskum v tejto oblasti má už dobré organizačné zabezpečenie. V roku 2001 bola založená Human Proteome Organization (HUPO), medzinárodná organizácia, ktorá združuje a riadi úsilie vedcov.

Proteomika je klasickým príkladom interdisciplinárnej vedy: spája biológiu, chémiu, počítačové modelovanie a komplexnú inštrumentálnu technológiu.

Oficiálna stránka HUPO podrobne popisuje hlavné oblasti výskumu, ktorých zoznam môže veľa povedať aj neodborníkovi: ľudský proteóm, proteomika mozgu, štúdium protilátok, choroby spôsobené poruchami metabolizmu cukrov, proteomika kardiovaskulárnych chorôb, proteomika kmeňových buniek, stanovenie biomarkerov chorôb, štúdium chorôb človeka na myšacích modeloch a pod.

Metodologicky je v proteomike viacero oblastí, medzi hlavné patrí funkčná, štrukturálna a medicínska (klinická) proteomika.

Ciele funkčnej proteomiky už boli spomenuté vyššie. Ide o získavanie informácií o proteín-proteínových interakciách a ich vplyve na expresiu a moduláciu génovej aktivity, ako aj o posttranslačnej modifikácii proteínov v proteínových komplexoch.

Napriek tomu, že štrukturálna proteomika je klasickou oblasťou výskumu proteínov, naďalej sa aktívne rozvíja vďaka zlepšeniam v analytických metódach, ako sú nové verzie NMR spektroskopie, röntgenovej difrakčnej analýzy a hmotnostnej spektrometrie.

AKO SA MOLEKULY NAUČILI „LIETAŤ“

Moderné hmotnostné spektrometrické metódy sú inštrumentálnym základom proteomiky, metabolomiky, farmakokinetiky a iných „omík“.


Čo meria hmotnostný spektrometer? Presne povedané, nezisťuje hmotnosť molekuly, ale pomer m/z (pomer hmotnosti iónu k jeho náboju). V hmotnostnom spektrometri môžu mať rovnaké molekuly často rôzne náboje, a preto môžu byť detekované v rôznych časoch. Je jasné, že molekuly bez náboja (neutrálne) neinteragujú s elektrickým a (alebo) magnetickým poľom a sú neviditeľné pre hmotnostný spektrometer.
Celá história tejto mladej vedy je plná mien laureátov Nobelovej ceny. Za tvorcu prvého hmotnostného spektrometra je právom považovaný profesor Cambridge University J. Thompson (Nobelova cena za fyziku 1906), ktorý na samom začiatku 20. stor. storočí pozorovali zmeny v pohybe iónov pod vplyvom elektromagnetického poľa. Na základe týchto pozorovaní vytvoril „parabolický spektrograf“, v ktorom sa molekulárne ióny pohybovali v elektrickom poli pozdĺž parabolických trajektórií a boli detekované žiarou luminiscenčnej obrazovky.
Túto prácu vyvinul a zdokonalil Thompsonov kolega profesor F. Aston, ktorý získal v roku 1922 Nobelovu cenu za chémiu za vytvorenie hmotnostného spektrografu.


Profesor A. Dempster z University of Chicago zároveň pracoval na zvýšení účinnosti ionizácie molekúl v hmotnostnom spektrometri. V roku 1918 vytvoril hmotnostný spektrometer, v ktorom boli molekuly ionizované usmerneným tokom elektrónov. Táto metóda je stále hlavnou metódou ionizácie malých, vysoko prchavých molekúl. Sám autor použil prístroj na určenie izotopového zloženia prvkov. Keďže sa stal plnohodnotným účastníkom „jadrových pretekov“, objavil v roku 1935 izotop uránu 235 U. Jeho nasledovník, profesor na univerzite v Minnesote A. Nier, sa stal jedným z kľúčových účastníkov projektu Manhattan: prvej atómovej bomby bol vytvorený z 235 U, izolovaný Nierom pomocou hmotnostného spektrometra.
Vývoj a zdokonaľovanie metód separácie a identifikácie molekulárnych iónov prebiehalo v smere vytvárania fyzikálnych modelov, ktoré umožňujú rozlišovať ióny podľa ich charakteristík. Najzrejmejším spôsobom je nechať ióny lietať vo vákuu a separovať sa podľa ich rýchlostí ako deriváty molekulovej hmotnosti. V roku 1946 teda profesor Pennsylvánskej univerzity W. Stephens navrhol hmotnostnú spektrometriu s časom letu. Táto metóda je založená na skutočnosti, že všetky ióny sú urýchľované elektrickým poľom a prijímajú rovnakú kinetickú energiu. Rýchlosť každého z nich závisí od pomeru m/z, čo uľahčuje ich určenie.
Alternatívna metóda na separáciu molekulárnych iónov v polovici 50. rokov 20. storočia. navrhol profesor W. Paul z univerzity v Bonne. Vyvinul metódu oddeľovania iónov v striedavom elektrickom poli, čím položil základ pre ďalší typ hmotnostného spektrometra - iónovú pascu. Štvorpólový lapač Paul využíva konštantné a striedavé (rádiofrekvenčné) elektrické polia na zachytávanie (separačných) iónov. Hoci presnosť tejto metódy je výrazne nižšia ako presnosť hmotnostného spektrometra s časom letu, má výhody v rýchlosti skenovania a dynamickom rozsahu. Iónové pasce sú preto ideálnymi detektormi na analýzu v metabolomike, farmakológii, environmentálnych štúdiách a ich tvorcovi bola v roku 1989 (spolu s H. Demeltom) udelená aj Nobelova cena za fyziku.

Hmotnostný spektrometer, ktorého základy boli položené v 20. rokoch minulého storočia, sa úspešne používa dodnes. Tento vynikajúci laboratórny prístroj, schopný veľmi presne charakterizovať chemické prvky aj malé organické molekuly, bol a zostáva stálym a spoľahlivým pomocníkom pre syntetických chemikov.


Na druhej strane sa ukázalo ako nemožné analyzovať biologické makromolekuly pomocou tradičných hmotnostných spektrometrov, pretože biopolyméry nemožno ionizovať a premeniť na plynné skupenstvo zahrievaním alebo ožarovaním elektrónovými lúčmi. (Takmer každý z nás sa z vlastnej skúsenosti presvedčil o pravdivosti tohto tvrdenia: praženica zabudnutá na sporáku pripáli na panvicu a neodparí sa.)
Široké využitie hmotnostnej spektrometrie pri štúdiu štruktúry a funkcie proteínov a peptidov sa stalo možným len vďaka technologickému prelomu, ktorý nastal v 80. rokoch 20. storočia, keď boli vyvinuté nové metódy ionizácie, ktoré boli vhodné pre biomolekuly.
V roku 1983 tím profesora z Yale University J. Fenna navrhol metódu elektrosprejovej ionizácie, pri ktorej sa tvorba iónov dosahovala rozprašovaním roztoku vzorky pri prechode cez kapiláru, na ktorú bolo aplikované vysoké napätie.
Nemecký tím F. Hillenkampa zároveň navrhol metódu ionizácie organických molekúl ožarovaním ich vysušených vzoriek ultrafialovým laserom. V tomto prípade sa molekuly odparili a ionizovali spolu s pevnou prchavou organickou hmotou – matricou. To bol zrod azda najpopulárnejšej a v súčasnosti žiadanej metódy biologickej hmotnostnej spektrometrie - MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization).
Voľba matricovej látky a výber optimálneho pomeru látka/matrica určuje citlivosť metódy z dôvodu čo najefektívnejšieho prechodu testovanej látky do plynnej fázy.


Tri roky po Hilenkampovej publikácii K. Tanaka, zamestnanec japonskej spoločnosti Shimadzu, navrhol hotové riešenie pre hmotnostnú spektrometriu proteínov s hmotnosťou do 100 kDa - hmotnostný spektrometer MALDI s časom letu. Aby sme boli spravodliví, treba poznamenať, že použité matrice boli tekuté: proteíny boli rozpustené v glycerole, v ktorom boli suspendované mikročastice kovového kobaltu.
Tieto práce boli ocenené Nobelovou komisiou v roku 2002: Fenn a Tanaka sa podelili o cenu v chémii za vývoj mäkkých metód na ionizáciu biomolekúl v hmotnostnej spektrometrii.

V moderných spektrometroch je bežným analyzátorom pre MALDI hmotnostný spektrometer doby letu. Molekulové ióny sa pohybujú vo vákuovej trubici a dostávajú sa k detektoru v poradí s rastúcou hmotnosťou.
Účinnosť získavania (registrácie) iónov v hmotnostnej spektrometrii MALDI závisí od mnohých parametrov: spôsobu prípravy a čistenia vzorky; kvantitatívny pomer matrice k analytu a správny výber materiálu substrátu. Dôležitými podmienkami na získanie stabilného signálu sú výkon laserového žiarenia, výber „horúceho bodu“ na vzorke a tlak v ionizačnej oblasti.
Pre hmotnostné spektrometre s elektrosprejovými iónovými zdrojmi sa ako analyzátory najčastejšie používajú iónové pasce. V súčasnosti je kombinácia kvadrupólu s elektrosprejovým iónovým zdrojom jedným z najčastejšie používaných nástrojov v biochémii a metabolomike.
Obidve hmotnostné spektroskopické metódy majú svoje výhody a nevýhody. Po prvé, vyžadujú vysokú chemickú čistotu analytu. ESI je „mäkšia“ ionizačná metóda ako MALDI. Pri ESI sa tvorí súvislý prúd iónov, pri MALDI sa vytvára časovo veľmi obmedzený (do 10 ns) balík iónov; v tomto prípade viac ako 10 femtomólov látky podlieha analýze ESI, MALDI – 10-krát menej.
Ale všetky tieto poznámky sú čisto technické a len naznačujú, že metódy hmotnostnej spektrometrie biologických molekúl sa dnes stali dostupnými a sú široko používané vo vedeckých experimentoch a klinických štúdiách. Okrem toho sa silné stránky týchto metód navzájom dobre dopĺňajú a slúžia ako skutočne silný analytický nástroj.
...Dejiny vývoja hmotnostnej spektrometrie siahajú do dnešného dňa na druhú stovku rokov. Ale len nedávno, ako povedal John Fenn vo svojej Nobelovej prednáške, "...molekulárne slony boli schopné lietať na iónových krídlach."

Lekárska proteomika je nová a sľubná oblasť biomedicínskeho výskumu, ktorá umožňuje doslova prispôsobiť výdobytky funkčnej proteomiky, genomiky a bioinformatiky priamo „životu“, teda využiť existujúce poznatky na klinickú analýzu biologických vzoriek odobratých z pacientov.

Moderné úspechy

Na hľadaní proteomických markerov významných ochorení intenzívne pracujú výskumníci po celom svete – nielen vedci z akademických inštitúcií, ale aj špecialisti z výskumných oddelení veľkých a stredných farmaceutických spoločností.

Určitý pokrok sa už dosiahol v jednej z najproblematickejších oblastí medicíny – včasnej diagnostike závažných ochorení. Týka sa to predovšetkým rakoviny prostaty (Downes a kol., 2007; Larkin a kol., 2010). Diagnóza tohto rozšíreného ochorenia, ktorá sa vykonáva na základe prítomnosti prostatického špecifického antigénneho proteínu v moči pacienta, je dnes jednou z prvých a najpresnejších.

Doteraz sa dosiahli dobré výsledky pri identifikácii markerov rakoviny prsníka (Mathelin a kol., 2006; Gast a kol., 2009). Kvôli širokej klinickej variabilite tohto ochorenia bol navrhnutý súbor 40 proteínov ako markerov. Tento proteínový profil umožňuje nielen presne diagnostikovať ochorenie, ale aj predpovedať účinnosť liečby. Hlavné diagnostické proteíny tohto súboru – haptoglobín, transferín, apolipoproteíny A-I a C-I – sa už dnes využívajú v diagnostike rakoviny prsníka.

Prebiehajú aj výskumy na detekciu markerov neurodegeneratívnych ochorení, akými sú Alzheimerova choroba, skleróza rôznej etiológie a pod.(Cedazo-Minguez, Winblad, 2010). V tejto oblasti sú hlavnými prognostickými markermi angiogenín (enzým zabezpečujúci rast ciev), kreatinínkináza, fibrinogén, apolipoproteín E (Bowser, Lacomis, 2009)

Na Sibíri sa problematika štrukturálnej a funkčnej proteomiky intenzívne študuje na Novosibirskom inštitúte chemickej biológie a základnej medicíny SB RAS. V dôsledku spoločnej práce s Výskumným ústavom duševného zdravia Tomského vedeckého centra sibírskej pobočky Ruskej akadémie lekárskych vied sa vykonalo veľa práce na hľadaní proteínových markerov schizofrénie.

Etiológia a patogenéza tohto závažného duševného ochorenia nie sú známe. Podľa jednej teórie o výskyte schizofrénie je ochorenie založené na poruche metabolizmu bielkovín. Porovnanie proteomických profilov štatisticky významnej vzorky ľudí trpiacich schizofréniou a proteomických profilov zdravých dobrovoľníkov už umožnilo výskumníkom identifikovať určitý súbor proteínov ako markerov: apolipoproteín A-II, fosfomevalonátkinázu a serín (treonín)kinázu. Ďalšie úsilie vedcov bude smerovať k objasneniu úlohy týchto proteínov v patogenéze ochorenia a zavedeniu týchto markerov do klinickej biochémie.

Práca výskumníkov v oblasti proteomiky má obrovský potenciál a perspektívu. Vzhľadom na to, že v ľudskom tele môže byť množstvo rôznych proteínových molekúl a ich variantov milióny, vedci sú presvedčení, že ich high-tech proteínový „lov“ bude aj naďalej zaručene prinášať bohatý úlovok. Úspechy posledných rokov v tejto novej biomedicínskej oblasti inšpirujú k rozumnému optimizmu.

Literatúra

Cox J., Mann M. Je proteomika novou genomikou? // Bunka. 2007. V. 130 ods. S. 395-398.

Capelo J.L., Carreira R., Diniz M. a kol. Prehľad moderných prístupov na urýchlenie pracovných postupov identifikácie proteínov založených na enzymatickom štiepení a technikách založených na hmotnostnej spektrometrii // Anal. Chim. Acta. 2009. V. 650. N 2. S. 151-159.

Ulrich-Merzenich G., Pánek D., Zeitler H. a kol. Nové perspektívy pre výskum synergie s „omickými“ technológiami // Fytomedicína. 2009. N. 6-7. S. 495-508.

Feng X., Liu X., Luo Q., Liu B.F. Hmotnostná spektrometria v biologických systémoch: prehľad // Mass Spectrom. Rev. 2008. V. 6. S. 635-660.

Proteomika

A.A. ZAMYATNIN, doktor biologických vied, Ústav biochémie pomenovaný po. A.N.Bach RAS

Náš príbeh bude venovaný jednej z najmladších základných vied (ak nie najmladšej), ktorá sa zrodila len pred pár rokmi spolu s tými, ktorí ešte len navštevujú základnú školu. Na rozdiel od mnohých iných vied o proteomike môžete presne povedať, za akých okolností vznikla, uviesť rok, kedy sa objavil jej názov a kto ho vymyslel.

Začnime okolnosťami. V druhej polovici 20. stor. Analytické metódy biochémie, molekulárnej biológie a výpočtovej techniky sa rýchlo rozvíjali. Pozoruhodný pokrok dosiahnutý v týchto oblastiach viedol k schopnosti dešifrovať obrovské sekvencie báz nukleových kyselín a zaznamenať úplný genóm živého organizmu. Kompletný genóm bol prvýkrát dešifrovaný v roku 1980 pre bakteriofág phi X-174 (asi 5 103 báz), potom pre prvú baktériu Haemophilus influenzae (1,8 106 báz). A s koncom 20. storočia. Obrovská práca na dešifrovaní kompletného ľudského genómu bola dokončená – identifikáciou sekvencie približne 3 miliárd báz nukleových kyselín. Na túto prácu bolo vynaložených niekoľko miliárd dolárov (asi jeden dolár na základňu). Celkovo sa už podarilo rozlúštiť genómy niekoľkých desiatok druhov živých organizmov. V tomto období sa objavili dve nové biologické vedy: v roku 1987 sa vo vedeckej tlači prvýkrát použilo slovo „genomika“ a v roku 1993 „bioinformatika“.

V každom biologickom druhu je časť genómu reprezentovaná oblasťami kódujúcimi aminokyselinové sekvencie proteínov. Napríklad u ľudí existuje asi 100 000 takýchto oblastí (podľa niektorých odhadov môže toto číslo dosiahnuť 300 000 a pri zohľadnení chemicky modifikovaných štruktúr - niekoľko miliónov). Zdalo by sa, že so znalosťou kompletného genómu a genetického kódu je možné získať všetky informácie o štruktúre proteínov prostredníctvom translácie. Všetko však nie je také jednoduché. Postupne sa ukázalo, že v danom bunkovom systéme uvažovaného tela neexistuje žiadna korelácia medzi súbormi mRNA a proteínov. Okrem toho mnohé proteíny syntetizované na ribozómoch v súlade s nukleotidovou sekvenciou podliehajú po syntéze chemickým modifikáciám a môžu existovať v tele v modifikovaných a nemodifikovaných formách. A tiež je dôležité, že proteíny majú rôzne priestorové štruktúry, ktoré sa dnes nedajú určiť lineárnymi sekvenciami nukleotidov a dokonca ani aminokyselín. Naliehavou úlohou preto zostáva priama izolácia a stanovenie štruktúr všetkých fungujúcich proteínov (priame stanovenie štruktúry sa doteraz uskutočnilo približne len u 10 % ľudských proteínov). Popri genomike sa tak objavil pojem „proteomika“, ktorej predmetom skúmania je proteóm (z anglického PROTEins - proteíny a genOMe - genóm). A vo vedeckej tlači sa zmienka o proteóme prvýkrát objavila v roku 1995.

Je potrebné dodať, že početné krátke fragmenty proteínových prekurzorov, nazývané oligopeptidy alebo jednoducho peptidy, hrajú hlavnú úlohu v živote organizmov. Práve kvôli nim existuje taký rozpor v hodnotení množstva proteín-peptidových zložiek u predstaviteľov rovnakého biologického druhu. Preto sa spolu s pojmami „proteóm“ a „proteomika“ v súčasnosti používajú také pojmy ako „peptidóm“ a „peptidomika“, ktoré sú súčasťou proteómu a proteomiky. O rozmanitosti štruktúry a funkcií proteínov a peptidov sme už hovorili na stránkach novín Biology.

Sformulujme teda definície nových vied, ktoré vznikli počas života súčasnej mladej generácie a ktoré sú navzájom úzko prepojené (obr. 1).

Genomika je veda, ktorá študuje štruktúru a funkcie génov (genóm je súhrn všetkých génov organizmu).

Bioinformatika je veda, ktorá sa zaoberá štúdiom biologických informácií pomocou matematických, štatistických a počítačových metód.

Proteomika je veda, ktorá študuje súhrn bielkovín a ich interakcie v živých organizmoch (proteóm je súhrn všetkých bielkovín v tele).

Všimnite si tiež, že proteomika vo všeobecnosti zahŕňa štrukturálnu proteomiku, funkčnú proteomiku a aplikovanú proteomiku, o ktorých budeme diskutovať samostatne.

Štrukturálna proteomika

Najvýraznejšou črtou biológie je rozmanitosť. Je viditeľný na všetkých úrovniach biologickej organizácie (biologické druhy, morfológia, chemická štruktúra molekúl, sieť regulačných procesov atď.). To plne platí pre bielkoviny. Rozsah ich štrukturálnej rozmanitosti ešte nebol úplne odhalený. Stačí povedať, že počet aminokyselinových zvyškov v jednom proteíne sa môže pohybovať od dvoch (minimálna štruktúra s peptidovou väzbou) až po desaťtisíce a ľudský titínový proteín obsahuje 34 350 aminokyselinových zvyškov a je v súčasnosti držiteľom rekordu – tzv. najväčšia zo všetkých známych proteínových molekúl.

Na získanie informácií o proteóme je potrebné ho najskôr izolovať a vyčistiť od ostatných molekúl. Keďže počet proteínov v celom proteóme (t. j. v celom organizme) je veľmi veľký, zvyčajne odoberú iba časť organizmu (jeho orgán alebo tkanivo) a rôznymi metódami izolujú proteínovú zložku. Počas takmer 200-ročnej histórie štúdia proteínov bolo vyvinutých mnoho metód na izoláciu proteínov – od jednoduchého vyzrážania solí až po moderné komplexné metódy, ktoré zohľadňujú rôzne fyzikálne a chemické vlastnosti týchto látok. Po získaní čistej frakcie jednotlivého proteínu sa určí jeho chemická štruktúra.

V štrukturálnej proteomike sa neurčuje štruktúra nie jedného, ​​ale mnohých proteínov naraz a dodnes sa na to vyvinula špeciálna séria postupov a vytvoril sa arzenál zodpovedajúcich vysoko presných prístrojov. (Kompletná sada zariadení na proteomický výskum stojí viac ako jeden milión dolárov.)

Na obr. Obrázok 2 znázorňuje diagram laboratórneho cyklu od prípravy vzorky až po určenie jej štruktúry. Po izolácii a čistení (obrázok ukazuje už izolovaný a purifikovaný prípravok) sa proteíny separujú pomocou dvojrozmernej elektroforézy. Táto separácia prebieha v dvoch smeroch: v jednom sa oddelia molekuly proteínov s rôznou hmotnosťou, v druhom sa oddelia rôzne celkové elektrické náboje. Výsledkom tohto delikátneho postupu je, že identické molekuly sú zoskupené na špeciálnom nosiči a vytvárajú makroskopické škvrny a každá škvrna obsahuje iba identické molekuly. Počet škvŕn, t.j. počet rôznych proteínov alebo peptidov môže byť mnoho tisíc (obr. 3, 4) a na ich štúdium sa používajú automatické zariadenia na spracovanie a analýzu. Potom sa škvrny vyberú a látky, ktoré obsahujú, sa zavedú do zložitého fyzikálneho zariadenia – hmotnostného spektrometra, pomocou ktorého sa určí chemická (primárna) štruktúra každého proteínu.

Primárna štruktúra proteínu môže byť tiež určená pomocou výsledkov genomiky a bioinformatiky. Na obr. Obrázok 5 ukazuje úplnú štruktúru génu ľudského sérového albumínu. Obsahuje 1830 dusíkatých báz kódujúcich 610 aminokyselinových zvyškov. Tento gén, podobne ako veľká väčšina iných, začína atg kodónom, kódujúcim metionínový zvyšok, a končí jedným zo stop kodónov, v tomto prípade taa. Toto kóduje štruktúru pozostávajúcu zo 609 aminokyselinových zvyškov (obr. 6). Táto štruktúra však ešte nie je molekulou sérového albumínu, ale len jeho prekurzorom. Prvých 24 aminokyselinových zvyškov je takzvaný signálny peptid, ktorý sa pri prechode molekuly z jadra do cytoplazmy odštiepi a až potom sa vytvorí štruktúra sérového albumínu, ktorý sa získa izoláciou tohto proteínu. . Výsledkom je, že táto molekula obsahuje 385 aminokyselinových zvyškov.

Sekvencia aminokyselín však neodhaľuje priestorovú štruktúru proteínu. Z hľadiska termodynamiky je predĺžená lineárna štruktúra energeticky nevýhodná, a preto sa sekvenčne špecifickým spôsobom skladá do jedinečnej priestorovej štruktúry, ktorú je možné určiť pomocou dvoch výkonných fyzikálnych metód - röntgenovej difrakčnej analýzy a nukleárnej magnetickej rezonancia (NMR spektroskopia). Pomocou prvého z nich boli určené priestorové štruktúry niekoľkých tisícok proteínov, vrátane ľudského sérového albumínu, ktorého obraz je uvedený na obr. 7. Táto štruktúra sa na rozdiel od primárnej (sekvencia aminokyselín) nazýva terciárna a sú v nej dobre viditeľné špirálovité úseky, ktoré sú prvkami sekundárnej štruktúry.

Úloha štrukturálnej proteomiky teda spočíva v izolácii, čistení, určovaní primárnych, sekundárnych a terciárnych štruktúr všetkých proteínov živého organizmu a jej hlavnými nástrojmi sú dvojrozmerná elektroforéza, hmotnostná spektrometria a bioinformatika.

Bioinformatika proteínov

Existencia obrovského množstva rôznych proteínov viedla k potrebe vytvárať informačné polia – databázy (alebo banky) údajov, do ktorých by boli vložené všetky známe informácie o nich. V súčasnosti existuje veľa všeobecných a špecializovaných databáz, ktoré sú dostupné na internete každému. Všeobecné databázy obsahujú informácie o všetkých známych bielkovinách živých organizmov, t.j. o globálnom proteóme všetkého živého. Príkladom takejto databázy je SwissProt-TrEMBL (Švajčiarsko-Nemecko), ktorá v súčasnosti obsahuje štruktúry takmer 200 000 proteínov určených analytickými metódami a takmer 2 milióny ďalších štruktúr, ktoré boli určené ako výsledok translácie z nukleotidových sekvencií. Na obr. 8 a 9 ukazujú počet existujúcich proteínov, ktoré sú známe pre každý daný počet aminokyselinových zvyškov. Osi x v týchto grafoch sú obmedzené na 2000 zvyškov, ale ako je uvedené vyššie, aj keď nie často, vyskytujú sa výrazne väčšie molekuly. Z údajov uvedených na obrázkoch vyplýva, že najväčší počet proteínov obsahuje niekoľko stoviek aminokyselinových zvyškov. Patria sem enzýmy a iné pomerne mobilné molekuly. Medzi väčšími proteínmi je veľa takých, ktoré plnia podporné alebo ochranné funkcie, držia biologické štruktúry pohromade a dodávajú im silu.

V globálnom proteóme zaujímajú osobitné miesto malé, veľmi mobilné molekuly, ktoré neobsahujú viac ako 50 aminokyselinových zvyškov a majú špecifické spektrum funkčnej aktivity. Nazývajú sa oligopeptidy alebo jednoducho peptidy. Pre nich, t.j. pre globálny peptidóm bola vytvorená špeciálna databanka s názvom EROP-Moskva. Tento názov je skratkou výrazu Endogenous Regulatory OligoPeptides a označuje, že banka bola vytvorená a sídli v hlavnom meste našej krajiny. Doteraz bola rozlúštená štruktúra takmer 6000 oligopeptidov izolovaných zo zástupcov všetkých živých kráľovstiev. Rovnako ako veľké proteíny, počet oligopeptidov s daným počtom aminokyselinových zvyškov môže byť znázornený graficky (obr. 10). Súdiac podľa grafu, najbežnejšie oligopeptidy sú tie, ktoré obsahujú približne 8-10 aminokyselinových zvyškov. Medzi nimi obsahujú najmä molekuly, ktoré sa podieľajú na regulácii nervového systému, a preto sa nazývajú neuropeptidy. Je zrejmé, že najrýchlejšie procesy v živom organizme prebiehajú za účasti nervového systému, takže regulátory peptidov musia byť mobilné a teda malé. Treba však poznamenať, že vzhľadom na obrovskú štrukturálnu a funkčnú rozmanitosť proteínov aj peptidov pre ne ešte nebola vytvorená prísna klasifikácia.

Úlohou bioinformatiky je teda v tomto prípade zhromažďovanie informácií o fyzikálno-chemických a biologických vlastnostiach proteínov, analýza týchto informácií, katalogizácia a príprava informačnej bázy a výpočtových nástrojov na identifikáciu mechanizmov ich fungovania.

Funkčná proteomika

Prítomnosť konkrétneho proteínu v tele dáva dôvod predpokladať, že má (alebo mal) určitú funkciu a celý proteóm slúži na zabezpečenie plného fungovania celého organizmu. Funkčná proteomika sa zaoberá zisťovaním funkčných vlastností proteómu a problémy, ktoré rieši, sú oveľa zložitejšie ako napríklad určovanie proteínovo-peptidových štruktúr.

Je zrejmé, že fungovanie proteómu prebieha vo viaczložkovom prostredí, v ktorom sa nachádza množstvo molekúl iných chemických tried – cukry, lipidy, prostaglandíny, rôzne ióny a mnohé ďalšie, vrátane molekúl vody. Je možné, že po určitom čase sa objavia výrazy ako „cukor“, „lipid“ a podobne. Proteínové molekuly interagujú s inými alebo podobnými štruktúrami, ktoré ich obklopujú, čo v konečnom dôsledku vedie k vzniku funkčných reakcií, najskôr na molekulárnej úrovni a potom na makroskopickej úrovni. Mnohé takéto procesy sú už známe, vrátane tých, ktoré zahŕňajú proteíny. Tieto zahŕňajú interakciu enzýmu so substrátom, antigénu s protilátkou, peptidov s receptormi, toxínov s iónovými kanálmi atď. (receptory a iónové kanály sú tiež proteínové štruktúry). Na identifikáciu mechanizmov týchto procesov sa uskutočňujú experimentálne štúdie jednotlivých účastníkov interakcie a systémové štúdie s využitím bioinformatiky. Pozrime sa na niekoľko príkladov takýchto systémových prístupov.

Na obr. Na obrázku 11 sú zástupcovia ľudského proteómu (v tomto prípade peptidómu) – rôzne gastríny a cholecystokiníny, ktoré sú lokalizované v gastrointestinálnom trakte (pri písaní aminokyselinových sekvencií bol použitý štandardný jednopísmenový kód, ktorého dekódovanie bolo nami poskytnuté skôr). Funkčné časti týchto peptidových molekúl sú veľmi podobné oblasti na pravej strane. Peptidy však majú priamo opačné behaviorálne vlastnosti: gastríny vyvolávajú u človeka pocit hladu a cholecystokiníny vyvolávajú u človeka pocit sýtosti. Tento rozdiel je zrejme spôsobený tým, že v primárnej sekvencii cholecystokinínov je poloha tyrozínového zvyšku Y posunutá o jeden krok v porovnaní s gastrínmi. Rovnaký obrázok ukazuje primárnu štruktúru cionínového peptidu získaného zo zástupcu prvoka chordáta Ciona intestinalis (obr. 12). Jeho štruktúra je homológna s gastrínmi aj cholecystokinínmi a je charakterizovaná dvomi tyrozínovými zvyškami umiestnenými v rovnakých polohách ako oba tieto peptidy. Bohužiaľ, jeho funkčné vlastnosti neboli študované. A správnym experimentálnym výskumom by bolo možné odpovedať na otázku, aká je úloha chemickej štruktúry všeobecne a tyrozínových zvyškov zvlášť pri prejave opačných fyziologických účinkov.

Ďalší príklad: na obr. Obrázok 13 ukazuje aminokyselinové sekvencie veľmi podobných molekúl, ktoré sú tiež kombinované do štrukturálne homológnej rodiny. Tieto molekuly sa nachádzajú vo veľmi evolučne vzdialených živých organizmoch – od hmyzu po cicavce. Prvý riadok udáva primárnu štruktúru bradykinínu, ktorý obsahuje 9 aminokyselinových zvyškov a nachádza sa v mnohých vyšších organizmoch, vrátane ľudí. V priebehu rokov chemici syntetizovali rôzne neprirodzené analógy tejto molekuly, aby odpovedali na otázku, ktorá jej časť je zodpovedná za interakciu s receptorom. Asi pred 30 rokmi boli dokonca syntetizované všetky možné fragmenty bradykinínu – 8 dipeptidov, 7 tripeptidov atď. (celkom možných 36 fragmentov), ​​ktorých veľkosť aktivity bola potom testovaná v rovnakom biologickom teste. Výsledok sa ukázal ako triviálny: ukázalo sa, že iba celá molekula vykazuje maximálnu aktivitu a každý fragment jednotlivo má buď stopovú alebo nulovú aktivitu. Táto namáhavá práca by nemusela byť vykonaná, ak by v tom čase boli známe ďalšie bradykiníny znázornené na obr. 13 a boli by izolované z globálneho proteómu pomocou bioinformatiky. Predložená štrukturálne homológna rodina jasne demonštruje, že všetky molekuly majú oblasť, ktorá zostala prakticky nezmenená v dôsledku biologickej evolúcie (kvázikonzervatívna oblasť), a predstavuje molekulu bradykinínu vyšších živých organizmov, ktorá je vo výsledku vybraná ako najdokonalejšia. evolučného procesu. Tento príklad ukazuje, že proteomika spolu s bioinformatikou dokáže rýchlo (a lacno) vyriešiť zásadné vedecké problémy.

A napokon tretím príkladom je štrukturálne homológna rodina cicavčích endotelínov a hadích toxínov (obr. 14). Napriek nápadnej podobnosti štruktúr sa ich funkčné vlastnosti navzájom výrazne líšia: niektoré sú veľmi užitočnými regulátormi vaskulárnej kontrakcie, zatiaľ čo iné sú smrteľné. V tomto prípade sa stretávame so situáciou, keď primárna štruktúra neobsahuje dostatočné informácie, ktoré by mohli vysvetliť dôvod rozdielnosti funkcií a je potrebné podrobnejšie zvážiť priestorovú (terciárnu) štruktúru. Na obr. Obrázky 15 a 16 ukazujú priestorové štruktúry dvoch členov tejto rodiny, endotelínu-1 a sarafotoxínu 6b, získaných pomocou NMR spektroskopie. Na obrázkoch sú otočené tak, aby sa dosiahla maximálna priestorová homológia. Úplnú homológiu však nemožno získať žiadnou rotáciou. V dôsledku toho, napriek veľkej podobnosti primárnych štruktúr, dochádza k ich interakcii s rôznymi receptorovými štruktúrami, a preto vedie k rôznym fyziologickým účinkom.

Samozrejme, nie je možné úplne charakterizovať rozmanitosť funkčnej proteomiky na takýchto konkrétnych príkladoch. Vytváranie predstáv o obrovskej sieti interakcií bielkovín a iných molekúl v tele si vyžaduje obrovskú prácu a využitie všetkých prostriedkov modernej bioinformatiky. V skutočnosti sa vytváranie takýchto reprezentácií len začína. Existuje však dôvod domnievať sa, že každý rok naše znalosti v tejto oblasti budú rýchlo rásť.

Jedným z prvých úspechov na tejto ceste je vytvorenie mapy metabolizmu karboxylových kyselín na Biochemickom ústave. A.N. Bacha z Ruskej akadémie vied (obr. 17). Táto mapa predstavuje sieť reakcií s pravidelnou periodickou štruktúrou. Tento prístup sa ukázal ako úspešný v dôsledku skutočnosti, že funkčne podobné metabolity prechádzajú podobnými biochemickými transformáciami, pričom vytvárajú funkčne podobné deriváty. Na mape sú zvislé riadky oblasti obsahujúce zlúčeniny s rovnakým počtom atómov uhlíka (od 1 do 10) a vodorovné riadky predstavujú riadky funkčne podobných metabolitov. Chemické štruktúry na mape sú spojené početnými šípkami označujúcimi, ktoré enzýmy (proteíny) sa podieľajú na príslušných chemických transformáciách. Nie je pravda, že tento prístup pripomína D.I. periodickú tabuľku chemických prvkov? Mendelejev? A rovnako ako Mendelejevov systém, aj táto mapa má predikčnú schopnosť. S jeho pomocou sa predpovedalo množstvo nových enzýmov, ktoré boli následne experimentálne objavené.

Podobné schémy možno rozšíriť aj na iné metabolické procesy (napríklad sacharidy, aminokyseliny atď.) a použiť ich aj na hľadanie nových metabolitov biochemických reakcií.

Funkčná proteomika teda študuje komplexné vzťahy medzi štruktúrou a funkciou proteómu.

Praktická proteomika

Hlavnou úlohou proteomiky je teda identifikovať mechanizmus interakcie veľkého množstva proteínov a peptidov v jednom organizme. Aký praktický význam má toto veľkolepé a drahé dielo? Je zrejmé, že výsledky takejto práce zaujímajú predovšetkým farmakológov a lekárov, pretože veľmi často existuje úzka súvislosť medzi zmenami v zložení bielkovín a chorobným stavom človeka. Nové dáta v proteomike preto budú (a už sa aj využívajú) na rýchly vývoj nových liekov a nových liečebných postupov chorôb, s ktorými medicína zápasí stáročia. Dnes 95% všetkých farmakologických činidiel ovplyvňuje proteíny. Proteomika so svojím systémovým prístupom môže pomôcť identifikovať a vyhodnotiť dôležitosť vznikajúcich proteínov oveľa efektívnejšie, čo následne urýchli vývoj nových diagnostických testov a terapeutík.

Prvá praktická aplikácia proteomického výskumu sa uskutočnila dávno predtým, ako sa objavil pojem „proteomika“, ešte na začiatku 20. storočia, keď bola objavená úloha inzulínu vo vývoji tak vážneho ochorenia, akým je cukrovka. Vytvorenie inzulínových liekov zachránilo životy miliónov ľudí.

V súčasnosti je proteomika spolu s genomikou a bioinformatikou zameraná na tvorbu nových liečiv (obr. 18), v ktorých budú určité proteíny slúžiť ako molekulárne ciele. Proces hľadania nových liekových cieľov je riešený pomocou bioinformatiky a predmetom analýzy je gén. Po analýze genómu je však potrebné získať dôkaz, že tento proteín je intenzívne exprimovaný a je v bunke v pracovnom stave. Proteomika tento problém rieši. Týmto spôsobom sa identifikuje molekulárne genetický cieľ pre liek.

Treba poznamenať, že samotná proteomika môže vyriešiť problém s nájdením cieľa. Ak získame proteomické mapy (podobné tým, ktoré sú uvedené na obr. 3 alebo 4) normálnych a patologických tkanív, potom z rozdielov v nich môžeme určiť, ktoré proteíny sú dôležité pre rozvoj konkrétneho patologického stavu, a vybrať ich ako ciele alebo použiť tieto poznatky na diagnostiku. Dá sa predpokladať, že v budúcnosti k rutinnému krvnému testovaniu pribudne aj tvorba proteomických krvných máp. Na tento účel budú musieť kliniky používať špeciálne vybavenie, pomocou ktorého sa bude pacientom pravidelne odoberať krv. Ak dôjde k chorobnému stavu, stačí porovnať proteomickú mapu chorého človeka s jeho vlastnou proteomickou mapou, ale zostavenou v čase, keď bol zdravý, a bude možné identifikovať zmeny, ktoré nastali v bielkovine. zloženie krvi a určiť príčinu ochorenia. Takéto porovnanie proteómov nádorových a normálnych buniek, buniek pred a po vystavení určitým faktorom (napríklad fyzikálnym alebo chemickým), použitie biologických tekutín na diagnostické účely - to všetko je veľmi zaujímavé a otvára úplne nové vyhliadky pre medicínu, veterinárnu medicínu, farmakológiu, potravinársky priemysel a ďalšie aplikačné oblasti. Čaká nás obrovská a zaujímavá práca.

Zoznam literatúre

1. Sanger F., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L. a kol. Nukliotidová sekvencia DNA bakteriofága phi X-174.//Príroda. 1977. V. 265, č. 5596. S. 687-695.

2. Fleischmann R.D., Adams M.D., White O. a kol. Náhodné sekvenovanie a zostavenie celého genómu Haemophilus influenzae Rd.//Science. 1995. V. 269, č. 5223. S. 496-512.

3. Príroda. 2001. 409, č. 6822 (väčšina čísla časopisu je venovaná dešifrovaniu ľudského genómu).

4. Ferguson-Smith A.C., Ruddle F.H. Genomika ľudských lokusov obsahujúcich homeobox.//Pathol. Imunopathol. Res. 1988. V. 7, č. 1-2. S. 119-126.

5. Franklin J. Bioinformatika mení tvár informácií.//Ann. NY Acad. Sci. 1993. V. 700. S. 145-152.

6. Wasinger V.C., Cordwell S.J., Cerpa-Poljak A. a kol. Pokrok v mapovaní génových produktov Mollicutes: Mycoplasma genitalium.//Elektroforéza. 1995. V. 16, č. 7. S. 1090-1094.

7. Zamyatnin A.A. Brilantný svet proteínov a peptidov.//Biológia. 2002. č. 25-26. S. 8-13.

8. Gorg A., Weiss W., Dunn M.J. Súčasná technológia dvojrozmernej elektroforézy pre proteomiku.//Proteomika. 2004. V. 4, č. 12. S. 3665-3685.

9. Ramstrom M., Bergquist J. Miniaturizovaná proteomika a peptidomika využívajúca kapilárnu kvapalinovú separáciu a hmotnostnú spektrometriu s vysokým rozlíšením.//FEBS Lett. 2004. V. 567, č. 1. S. 92-95.

10. http://au.expasy.org/sprot/

11. http://erop.inbi.ras.ru/

12. Malygin A.G. Metabolizmus karboxylových kyselín (periodická schéma). - M.: „Medzinárodný vzdelávací program“, 1999.

13. Archakov A.I. Čo je genomika? - Proteomika.//Vydanie. med. chémia. 2000. T. 46, č. 4. S. 335-343.

Hlavnou úlohou proteomiky je teda identifikovať mechanizmus interakcie veľkého množstva proteínov a peptidov v jednom organizme. Aký praktický význam má toto veľkolepé a drahé dielo? Je zrejmé, že výsledky takejto práce zaujímajú predovšetkým farmakológov a lekárov, pretože veľmi často existuje úzka súvislosť medzi zmenami v zložení bielkovín a chorobným stavom človeka. Nové dáta v proteomike preto budú (a už sa aj využívajú) na rýchly vývoj nových liekov a nových liečebných postupov chorôb, s ktorými medicína zápasí stáročia. Dnes 95% všetkých farmakologických činidiel ovplyvňuje proteíny. Proteomika so svojím systémovým prístupom môže pomôcť identifikovať a vyhodnotiť dôležitosť vznikajúcich proteínov oveľa efektívnejšie, čo následne urýchli vývoj nových diagnostických testov a terapeutík.

Prvá praktická aplikácia proteomického výskumu sa uskutočnila dávno predtým, ako sa objavil pojem „proteomika“, ešte na začiatku 20. storočia, keď bola objavená úloha inzulínu vo vývoji tak vážneho ochorenia, akým je cukrovka. Vytvorenie inzulínových liekov zachránilo životy miliónov ľudí.

V súčasnosti je proteomika spolu s genomikou a bioinformatikou zameraná na tvorbu nových liečiv (obr. 18), v ktorých budú určité proteíny slúžiť ako molekulárne ciele. Proces hľadania nových liekových cieľov je riešený pomocou bioinformatiky a predmetom analýzy je gén. Po analýze genómu je však potrebné získať dôkaz, že tento proteín je intenzívne exprimovaný a je v bunke v pracovnom stave. Proteomika tento problém rieši. Týmto spôsobom sa identifikuje molekulárne genetický cieľ pre liek.

Treba poznamenať, že samotná proteomika môže vyriešiť problém s nájdením cieľa. Ak získame proteomické mapy (podobné tým, ktoré sú uvedené na obr. 3 alebo 4) normálnych a patologických tkanív, potom z rozdielov v nich môžeme určiť, ktoré proteíny sú dôležité pre rozvoj konkrétneho patologického stavu, a vybrať ich ako ciele alebo použiť tieto poznatky na diagnostiku. Dá sa predpokladať, že v budúcnosti k rutinnému krvnému testovaniu pribudne aj tvorba proteomických krvných máp. Na tento účel budú musieť kliniky používať špeciálne vybavenie, pomocou ktorého sa bude pacientom pravidelne odoberať krv. Ak dôjde k chorobnému stavu, stačí porovnať proteomickú mapu chorého človeka s jeho vlastnou proteomickou mapou, ale zostavenou v čase, keď bol zdravý, a bude možné identifikovať zmeny, ktoré nastali v bielkovine. zloženie krvi a určiť príčinu ochorenia. Takéto porovnanie proteómov nádorových a normálnych buniek, buniek pred a po vystavení určitým faktorom (napríklad fyzikálnym alebo chemickým), použitie biologických tekutín na diagnostické účely - to všetko je veľmi zaujímavé a otvára úplne nové vyhliadky pre medicínu, veterinárnu medicínu, farmakológiu, potravinársky priemysel a ďalšie aplikačné oblasti. Čaká nás obrovská a zaujímavá práca.

Bibliografia

1.Sanger F., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L. a kol. Nukliotidová sekvencia DNA bakteriofága phi X-174.//Príroda. 1977. V. 265, č. 5596. S. 687–695.

2. Fleischmann R.D., Adams M.D., White O. a kol. Náhodné sekvenovanie a zostavenie celého genómu Haemophilus influenzae Rd.//Science. 1995. V. 269, č. 5223. S. 496–512.

3.Príroda. 2001. 409, č. 6822 (väčšina čísla časopisu je venovaná dešifrovaniu ľudského genómu).

4.Ferguson-Smith A.C., Ruddle F.H. Genomika ľudských lokusov obsahujúcich homeobox.//Pathol. Imunopathol. Res. 1988. V. 7, č.1–2. S. 119–126.

5.Franklin J. Bioinformatika mení tvár informácií.//Ann. NY Acad. Sci. 1993. V. 700. S. 145–152.

6.Wasinger V.C., Cordwell S.J., Cerpa-Poljak A. a kol. Pokrok v mapovaní génových produktov Mollicutes: Mycoplasma genitalium.//Elektroforéza. 1995. V. 16, č. 7. S. 1090–1094.

7. Zamyatnin A.A. Brilantný svet proteínov a peptidov.//Biológia. 2002. Číslo 25–26. S. 8–13.

8.Gorg A., Weiss W., Dunn M.J. Súčasná technológia dvojrozmernej elektroforézy pre proteomiku.//Proteomika. 2004. V. 4, č. 12. S. 3665–3685.

9.Ramstrom M., Bergquist J. Miniaturizovaná proteomika a peptidomika využívajúca kapilárnu kvapalinovú separáciu a hmotnostnú spektrometriu s vysokým rozlíšením.//FEBS Lett. 2004. V. 567, č. 1. S. 92–95.

10. http://au.expasy.org/sprot/

11 http://erop.inbi.ras.ru/

12. Malygin A.G. Metabolizmus karboxylových kyselín (periodická schéma). – M.: „Medzinárodný vzdelávací program“, 1999.

13. Archakov A.I. Čo je genomika? – Proteomika.//Vydanie. med. chémia. 2000. T. 46, č. 4. s. 335–343.

14. ru.wikipedia.org/wiki/Proteomics

15. www.biomed.spbu.ru/equipment/proteomics/

16. thesaurus.rusnano.com/wiki/article1579

17. www.inbi.ras.ru/ubkh/49/Terentiev.pdf

18. www.strf.ru/material.aspx?CatalogId=352&d_no=11979

19. www.tetronica.com/lcline/proteomics/proteomics.html

20. www.bionet.nsc.ru/bioinf/files/proneomika.pdf

21. www.bionet.nsc.ru/bioinf/files/proneomika.pdf

Funkčná genomika úzko súvisí a v skutočnosti sa prekrýva s najnovším smerom biológie, ktorý sa nazýva „ proteomika" - veda o proteómoch. Slovo "proteóm" je tvorené zo slova "proteín" (proteín) a konca slova "genóm", takže samotný názov akoby zlučoval "proteín" a "genóm" (DNA To zdôrazňuje ich úzky vzťah Avšak medzi genomikou a proteomikou, medzi genómom a proteómom, existuje jeden zásadný rozdiel, ktorý vedie k úplne novým výskumným metódam, novým stratégiám.

Proteome- dynamický koncept, pričom genóm je stabilný a konštantný, inak by nebolo možné prenášať dedičné vlastnosti z generácie na generáciu, zabezpečiť zachovanie druhov atď. Variabilita genómu vždy nastáva na pozadí jeho vysokej stability a v žiadnom prípade ju neruší. Proteóm je súbor bielkovín danej bunky v danej fáze jej vývoja v danom časovom bode, t.j. menší ako genóm z hľadiska celkovej informácie. V žiadnej bunke ľudského tela nikdy nefunguje všetkých približne 80 tisíc génov, funguje len časť z nich – niekedy menej, inokedy viac. Hoci je stále ťažké poskytnúť presné čísla, v bežnej špecializovanej bunke, napríklad v pečeňovej alebo pľúcnej bunke, pravdepodobne nie je súčasne prítomných viac ako 10 000 bielkovín a v výrazne odlišných množstvách - od niekoľkých molekúl na bunku až po niekoľko percent celkovej bunkovej veveričky. Súbor proteínov sa neustále mení v závislosti od fázy bunkového delenia, tkanivovej špecializácie bunky, štádia jej diferenciácie, či patrí medzi normálne alebo malígne bunky, od stavu stresu alebo pokoja, od pôsobenia extracelulárnych fyziologicky aktívnych látok, tak do nekonečna. Preto proteínový „portrét“ bunky závisí od mnohých faktorov a vplyvov a podlieha takmer nepretržitým zmenám, čo sťažuje jeho štúdium.

Existuje „buket“ proteomických technológií; každý má svoje výhody a nevýhody. Zamerajme sa na dva najúčinnejšie. Komplexnú zmes proteínov extrahovaných z bunky je možné separovať na nosiči (zvyčajne polyakrylamidový gél) v dvoch smeroch: v jednom budú proteíny oddelené podľa veľkosti (molekulová hmotnosť), v druhom podľa elektrického náboja (izoelektrický bod). ). Výsledkom je dvojrozmerná mapa obsahujúca mnoho stoviek bodov, z ktorých každý zodpovedá jednému alebo viacerým proteínom.

Ak má výskumník záujem o konkrétnu skupinu proteínov, môže byť identifikovaná na „mape“ a podrobená opakovanej separácii za mierne upravených podmienok s vyšším rozlíšením. Databanky teraz obsahujú informácie o mnohých rôznych typoch buniek, ktorých proteíny boli podrobené obojsmernej elektroforetickej separácii. Počítač dokáže porovnať takéto dvojrozmerné „proteínové mapy“ a izolovať, čo je v týchto typoch buniek rovnaké a v akých proteínoch sa líšia.

Metóda 2D mapy sa neustále zdokonaľuje a väčšina jednotlivých proteínových škvŕn, ktoré sú viditeľné na týchto mapách, už bola identifikovaná alebo je v procese identifikácie.

Najmodernejšia metóda identifikácie proteínov spočíva v tom, že skúmaný proteín je podrobený štiepeniu na fragmenty (peptidy) pomocou jedného alebo druhého enzýmu (proteázy). Výsledné peptidy sa potom separujú, zvyčajne pomocou vysokotlakovej chromatografie, a potom sa každý jednotlivý peptid umiestni do hmotnostného spektrometra a stanoví sa jeho hmotnosť. Porovnanie získaných výsledkov s výsledkami dostupnými v proteínových databázach umožňuje spoľahlivo identifikovať proteín, ak je známa jeho štruktúra. V prípade neznámeho proteínu táto metóda pomáha nájsť „príbuzných“, a tak formulovať predbežnú predstavu o jeho možnej funkcii.

Variabilita proteómu je spojená nielen so skutočnosťou, že v danom okamihu pracuje jedna časť génov av inom okamihu iná. Zloženie proteínov je vysoko závislé od procesov prebiehajúcich na ceste od DNA k messenger RNA (mRNA). Tu väčšina produktov primárnych génov (RNA) podlieha takzvanému „alternatívnemu zostrihu“, ktorého podstatou je, že pred vytvorením zrelej messengerovej RNA sa z nej odstránia rôzne časti molekuly. Výsledkom je, že jeden gén môže viesť k vzniku mnohých proteínov, ktoré sa líšia primárnou štruktúrou. Ukázalo sa teda, že jednu zo starých dogiem biochémie a molekulárnej biológie – „Jeden gén – jeden enzým“ – treba modernizovať. V mnohých prípadoch platí nasledujúci vzorec: "Jeden gén, veľa bielkovín."

V tejto súvislosti si treba uvedomiť, že proteíny po syntéze prechádzajú mnohými chemickými zmenami (modifikáciami), ktoré vytvárajú ich obrovskú diverzitu, hoci pôvodne boli kódované jediným génom. Takéto modifikácie zahŕňajú reakcie fosforylácie, acetylácie, metylácie, glykozylácie a mnohé ďalšie. Ak vezmeme do úvahy, že na veľkom proteíne je veľa miest, kde sa tieto modifikácie môžu vyskytnúť, je ľahké si predstaviť, aká takmer nekonečná rozmanitosť foriem tej istej molekuly proteínu môže vzniknúť. Prevažná väčšina modifikácií výrazne ovplyvňuje biologickú aktivitu danej molekuly proteínu, ako aj jej schopnosť interagovať s inými molekulami proteínu. Výsledkom je, že dospejeme k záveru, že keď v bunke funguje povedzme 10 % všetkých génov – povedzme 8 tisíc – potom počet rôznych proteínov môže túto hodnotu 10-krát prekročiť. Výskumníci už skôr predpokladali, že takáto situácia je možná, až teraz si však skutočne uvedomujú jej skutočný rozsah.

Za mimoriadne dôležité odvetvie proteomiky by sa, samozrejme, malo považovať štúdium interakcií proteín-proteín a proteín-nukleová kyselina. Počas života bunky takmer každý proteín počas svojho fungovania interaguje s rôznymi makromolekulami, ako aj s nízkomolekulárnymi ligandmi.

Na štúdium interakcií proteín-proteín sa v posledných rokoch rozšírila metóda takzvaných „dvojitých hybridov kvasiniek“. Pomocou genetického inžinierstva sa vytvorí konštrukt, ktorý pozostáva z časti DNA, ktorá interaguje s transkripčným faktorom a časti DNA kódujúcej „reportérsky gén“, ktorý zase kóduje enzýmový proteín, ktorého aktivita sa dá ľahko merať. Transkripčný faktor pozostáva z dvoch dominánt a funguje len vtedy, keď dominanty na seba vzájomne pôsobia. Ak chceme zistiť, či dva skúmané proteíny vzájomne interagujú, musíme izolovať transkripčný faktor a pripojiť požadovaný proteín ku každej z dominant. Keď interagujú, transkripčný faktor obnoví svoju aktivitu, čo umožní „reportérskemu génu“ pracovať a potom zistíte aktivitu „reportérskeho proteínu“. Ak skúmané proteíny neinteragujú, proteín-enzým sa nevytvorí.

Aplikácia dvojhybridného systému na bielkoviny človeka a iných organizmov umožnila dokázať, že existuje obrovské množstvo bielkovinovo-proteínových kontaktov rôznych typov a navyše objaviť mnohé dovtedy neznáme interakcie proteín-proteín. Tieto informácie sú mimoriadne dôležité pre identifikáciu komponentov signálnych dráh v bunke. Na prenose signálov z bunkového povrchu do jadra sa spravidla podieľajú „sprostredkujúce proteíny“, ktoré sa v bunke často nachádzajú v nepatrných koncentráciách, takže analýza signálnych dráh je pre experimentátorov veľmi náročná. Objav proteín-proteínových interakcií dramaticky zmenil situáciu.

Pri analýze interakcií proteín-nukleová kyselina sa široko používajú metódy „chemického zosieťovania“ týchto zložiek (napríklad pracovníci akademika A.A. Bogdanova identifikovali veľa dôležitých interakcií vo vnútri ribozomálnych častíc, kde v bunke prebieha biosyntéza proteínov).

Ďalšou vhodnou metódou je zmena elektroforetickej mobility počas tvorby komplexu, ktorá sa používa na analýzu rôznych kontaktov DNA-proteín a RNA-proteín. Pôvodnú verziu tejto metódy v kombinácii s „chemickým zosieťovaním“ vyvinul akademik A.D. Mirzabekov a používa sa na odhalenie štruktúry nukleozómu - elementárnej štruktúrnej jednotky pozostávajúcej z DNA a histónových proteínov, z ktorých sú postavené všetky chromozómy.